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葛花人参解酒护肝机制的研究  

2015-05-20 10:41:57|  分类: 科研论文 |  标签: |举报 |字号 订阅

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【作者】 戴雨霖

【导师】 刘淑莹;

【作者基本信息】 长春中医药大学, 中药学, 2014, 硕士

【摘要】 目的:本研究利用快速高分离度液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪(RRLC-Q-TOF)对解酒护肝作用中药葛花Pueraria lobata(Willd.)Ohwi.进行化学成分的研究,进而考察葛花与护肝滋补中药人参Panax ginseng C.A.Mey.的配伍作用。运用主成分分析(PCA)方法统计评价有效成分的体内体外活性和筛选。通过中药配伍和其机制的研究,开发安全有效的解酒护肝产品。方法:1、样本处理:根据2010年药典方法要求,制备葛花人参合煎液、葛花单煎液、人参单煎液、人参总皂苷以及人参粗多糖。0.22μm微孔滤膜过滤即为样品,4℃保存。2、LC-MS分析:采用快速分离液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪(Rapid resolution liquidchromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry, RRLC/Q-TOF-MS)对葛花和人参单煎和合煎液进行检测,获得色谱保留时间、高分辨质谱数据和串联质谱信息。3、酶活性实验:应用瓦勒-霍赫(Valle&Hoch)法体外测定药物对乙醇脱氢酶的活性影响,并且检验葛花人参对小鼠长期饮用酒精的肝中乙醇脱氢酶(ADH)的变化。在体内酶活性实验中,采用ELISA法测定肝脏MDA含量,GSH含量,ADH酶含量。4、数据分析:主成分分析(principal component analysis,PCA)对实验数据分析,以乙醇脱氢酶活性为分组标准,考察葛花人参单煎液和葛花人参混煎液的化学成分差异,寻找具有解酒护肝的化学成分。结果:1、在RRLC/Q-TOF-MS分析葛花水提取液,主要成分为异黄酮类及其苷类,并发现在葛花中存在皂苷类和酚类物质。一共鉴定了29种成分,在葛中首次发现同属植物狐尾葛Pueraria alopecuroides Craib特有化合物alopecuroides A和葛根中化合物3’-甲氧基大豆苷元-7-O-甲醚。2、在葛花人参配伍的研究中,PCA得分图(score plot)显示葛花人参单煎液与葛花人参混煎液完全分离,结果显示单煎液和混煎液在化学成分及含量上明显不同。3、在乙醇脱氢酶(ADH)的酶活性实验中,对ADH有促进作用的成分是:人参总皂苷和葛花水提取液。有抑制作用的是人参多糖。体内酶活性实验结果表明,与空白对照组比较,模型组MDA含量显著升高,GSH含量显著降低,ADH含量极显著降低;与模型组比较,解酒护肝片低、中、高剂量组显著降低,解酒护肝中、高剂量组显著升高,解酒护肝低、中、高剂量活性显著升高。结论:1、发现文献记载的葛花的主要的化学成分,葛花苷(kakkalide)、尼泊尔鸢尾素(irisolidone)、鸢尾苷(tectoridin)、鸢尾异黄酮(tectorigenin)、6"-O-木糖鸢尾苷(6"-O-xylosyl-tectoridin)和染料木苷(genistin)等等。由于只是采用水提取方式,一些不易溶于水的化合物未被检出。本实验详细阐述了葛花水溶液的质谱行为,首次在野葛中发现同属植物狐尾葛(Pueraria alopecuroides Craib)特有化合物Alopecuroides A。化合物中异黄酮成分含量最多,区分了异黄酮类化合物和黄酮类化合物。如黄酮类物质的主要碎裂途径是RDA断裂。而异黄酮类物质碎裂则很少类似行为。无论是异黄酮类还是黄酮类在碎裂行为中,均容易失去C环的C-O。容易失去甲氧基中的甲基。上述特征为葛花药材鉴别提供了准确、快速的分析方法。2、葛花人参配伍煎煮的过程中,人参可以促进葛花中的异黄酮类成分溶出,同时人参中的人参皂苷不但没有减少,反而有增加。可能是由于分子之间结构导致溶出度增大。乙醇脱氢酶(ADH)活性实验的研究结果表明其活性大小依次为合煎液>混合液≈葛花单煎液>人参单煎液,均与配伍相须作用物质基础的研究结果一致。葛花与人参配伍的体内酶活性实验,在体内验证了葛花人参的解酒护肝作用。3、小鼠在30天乙醇灌胃造模后,通过数据比较,显示造模成功。中、高剂量组可显著升高肝匀浆中肝损伤引起的GSH降低,提示自制解酒护肝提取物可通过增强机体GSH系统而起到对肝损伤细胞的保护作用。MDA是脂质过氧化反应过程中释放出的反应性醛,是脂质过氧化反应的终产物,可致细胞坏死,其含量的高低可反映肝损伤的程度。低、中及高剂量组可显著降低肝匀浆中肝损伤引起的MDA异常升高,提示解酒护肝提取物同时可通过抑制自由基和脂质过氧化物的产生,而起到对肝损伤细胞的保护作用。ADH是人体分解乙醇的主要酶类,肝脏中ADH的水平可以反映体内酒精代谢的情况,低、中及高剂量组可显著升高ADH活性,表明解酒护肝提取物组可以诱导ADH活性增强、促进乙醇的代谢,加速乙醇的排除体外,降低血清乙醇浓度。4、通过对葛花、人参提取条件、成型工艺进行优化,确定了最佳提取工艺及成型工艺,并建立了质量标准,完成了工业化小试生产,为今后批量生产和申报工作提供了实验数据,奠定了基础。

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